Voici comment vos tests de laboratoire sont analysés

Le NGS désigne l'ensemble des technologies qui permettent de lire l'ADN et l'ARN à grande échelle. Contrairement aux méthodes plus anciennes comme le séquençage Sanger, qui traitent les fragments un par un, le NGS lit des millions de fragments simultanément. De petites régions ciblées comme des génomes complets peuvent ainsi être analysés rapidement et avec une grande précision.

Il existe deux approches principales. Le séquençage à lectures courtes (par exemple Illumina) lit de courts fragments avec un débit élevé et un faible taux d'erreur : idéal pour la détection de variants et les applications à grande échelle. Le séquençage à lectures longues (par exemple Nanopore) lit des fragments plus longs en une seule fois, ce qui facilite l'assemblage d'un génome et est précieux pour la recherche épigénétique et les régions répétitives.

Le processus : les acides nucléiques sont d'abord isolés et leur qualité est contrôlée. Pour les analyses ciblées, ils sont amplifiés par PCR et munis d'un code-barres ; pour le séquençage du génome, le code-barres est ajouté directement. Les échantillons marqués sont regroupés (pooling) et purifiés avec des billes qui fixent l'ADN. Enfin, des adaptateurs sont ajoutés ; ils servent de point de départ au séquençage. La lecture elle-même a lieu dans la flowcell : chez Illumina, les fragments sont immobilisés et amplifiés ; chez Nanopore, les molécules passent à travers des nanopores, et des électrodes détectent le signal.

La PCR amplifie (de petits fragments d')ADN ou d'ADNc. En réalisant des millions de copies, on peut analyser même de très petites quantités de matériel génétique. Une PCR comporte 20 à 40 cycles de trois phases répétées : dénaturation, hybridation et élongation.

Pendant la dénaturation l'ADN est chauffé, ce qui rompt les liaisons hydrogène et donne deux molécules simple brin. Lors de l' hybridation de courts fragments d'ADN (les amorces) se fixent à un endroit précis, ce qui crée un point de départ pour la polymérase. Pendant l' élongation la polymérase allonge l'amorce avec de nouveaux nucléotides jusqu'à obtenir un fragment double brin. Ces étapes sont répétées jusqu'à obtenir suffisamment de copies.

On utilise pour cela un mastermix : un tampon, des dNTP (les éléments de base), des amorces et une polymérase résistante à la chaleur. Avec des amorces sens et antisens, les deux brins d'ADN sont copiés à chaque cycle. La quantité d'ADN augmente de façon exponentielle : un seul fragment peut donner un milliard de copies après 30 cycles. C'est ce qui rend la PCR indispensable au diagnostic moderne.

Le séquençage de l'ARNr 16S détermine la diversité, la structure et la composition des communautés bactériennes. Contrairement au séquençage du génome complet, cette méthode se concentre sur un seul gène marqueur présent dans presque toutes les bactéries : le gène de l'ARNr 16S.

Ce gène se compose de régions conservées et de régions hypervariables. Les régions conservées sont presque identiques chez de nombreuses bactéries et constituent l'endroit où se fixent les amorces. Les régions hypervariables diffèrent selon l'espèce et servent d'empreinte moléculaire. Pour le microbiome intestinal, on utilise souvent les régions V3 et V4, mais le meilleur choix dépend de la question de recherche et de la plateforme.

Le processus : l'ADN est d'abord isolé, puis les régions souhaitées sont amplifiées sélectivement par PCR, après quoi les amplicons sont lus par séquençage de nouvelle génération ou à lectures longues. Les séquences sont comparées par bio-informatique à une base de données de référence afin de déterminer quelles bactéries sont présentes et dans quelles proportions relatives.